ПЦР-анализПЦР-анализ (полимеразная цепная реакция) в настоящее время является самым современным и точным методом лабораторной диагностики различных инфекционных заболеваний. В 1993 году американский ученый Кэрри Мюллис за открытие метода ПЦР был удостоен Нобелевской премии.

В основе метода ПЦР лежит комплиментарное достраивание участка геномной ДНК или РНК возбудителя, осуществляемое в условиях пробирки с помощью фермента термостабильной ДНК-полимеразы, позволяющее выявлять в тканях и биологических жидкостях организма единичные клетки возбудителей многих инфекционных заболеваний, а также гены устойчивости к антибиотикам у микроорганизмов .

Использование ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет важное значение для решения многих проблем медицины, в том числе способствует диагностике хронических и малоизученных инфекционных заболеваний.

Взятие клинического материала для проведения ПЦР диагностики является наиболее «уязвимым» местом в ходе постановки реакции, требует обязательное наличие специальных транспортных сред, а также напрямую зависит от квалификации специалиста, выполняющего данную манипуляцию. Объектом исследования может служить любой биоматериал (соскоб клеток цервикального канала, уретры, отделяемое содержимого влагалища, моча, сок предстательной железы и т.д.), взятый от больного и доставленный в ПЦР-лабораторию.

В результате несложных манипуляций из полученного биоматериала выделяют нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК), являющиеся матрицей для реакции амплификации. Реакция амплификации представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 30-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой специфических праймеров, в количестве, достаточным для его детекции. Детекция продуктов амплификации осуществляется с помощью электрофореза в агарозном геле (большинство отечественных тест-систем) либо путем гибридизации со специфическим к последовательности ампликона олигонуклеотидным зондом.

ПРЕИМУЩЕСТВА МЕТОДА ПЦР КАК МЕТОДА ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ:

  • Прямое определение наличия возбудителей. Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.
  • Высокая специфичность. Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.
  • Высокая чувствительность. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-1000 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов – 103-105 клеток).
  • Универсальность процедуры выявления различных возбудителей.· Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК или РНК возбудителя. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы.
  • Высокая скорость получения результата анализа. Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени.
  • Возможность диагностики не только острых, но и латентных (скрытых) инфекций. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении внутриклеточных паразитов и возбудителей с высокой антигенной изменчивостью.

 

ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ ПЦР:

Универсальность подхода для выявления различных инфекционных агентов. Так как объектом исследования служит молекула ДНК, обладающая сходными химическими свойствами у всех организмов, процедуры выявления вирусной, бактериальной, человеческой ДНК одинаковы, что позволяет проводить комплексное исследование биопробы методом ПЦР.
Высокие показатели чувствительности и эффективности при выявлении возбудителей. Наряду с культуральным методом и микроскопией, ПЦР является прямым методом выявления возбудителя, но при этом обладает существенно большей чувствительностью. Чувствительность ПЦР достигает единичных копий возбудителя в биопробе, что позволяет существенно повысить эффективность выявления подразумевает выявление даже единичных клеток, что не доступно другим способам диагностики. Особое значение это приобретает при столкновении со скрытой или хронической формой заболевания, характеризующейся периодом остановки размножения возбудителя. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики представители микрофлоры с внутриклеточной или мембранной локализацией (Chlamydia trachomatis, представителей семейства Mycoplasma и др.), а также труднокультивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием и таких микроорганизмов в лабораторных условиях.
Применение метода ПЦР-диагностики позволяет избежать сложностей идентификации микроорганизмов, имеющих малые физические размеры и разнообразные формы, так как снимаются ограничения на размер и формы возбудителя, накладываемые использованием световой микроскопии с окраской мазка по Грамму.
Важное значение метод ПЦР-анализа имеет для мониторинга и оценки эффективности терапии, особенно при вирусных заболеваниях. Определение "вирусной нагрузки", т.е. количества вирусных частиц в крови позволяет осуществить индивидуальный подбор дозы противовирусных препаратов.
При помощи ПЦР удается выявить отдельные субтипы и штаммы вирусов и бактерий, обладающих повышенной устойчивостью к тем или иным лекарственным препаратам.
Возможность определения нескольких видов возбудителей (Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis, Ureaplasma urealyticum) из одной пробирки с биологическим материалом.
Этот метод сравним по трудоемкости с классическими методами (иммуноферментным, иммунофлуоресцентным и т.п.), но дает более достоверную диагностическую информацию, позволяя непосредственно обнаруживать ДНК или РНК инфекционного агента в клиническом материале. Поэтому метод ПЦР, наравне с культуральным методом, признается «золотым стандартом» для диагностики инфекционных заболеваний.

Наиболее эффективно и обоснованно использовать ПЦР-диагностику при урогенетальных инфекциях: трихомониазе, хламидиозе, уреаплазмозе, микоплазмозе, гонорее , герпесе, гарднереллезе.

  • В пульмонологии данный метод используется для дифференцированной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза.
  • В гастроэнтерологии - для выявления геликобактериоза.
  • В клинике инфекционных болезней - для диагностики вирусных гепатитов В,С, G.
  • В гематологии диагностируются цитомегаловирусная инфекция, вирус Эппштейн-Барра.

Особое практическое значение имеет определение устойчивости микрофлоры к антибиотикам: тетрациклину и эритромицину с помощью ПЦР-диагностики, что обоснованно применять тогда , когда другие методы недостаточно эффективны или приемлемы.